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Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒
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產品描述

本試劑盒用于檢測細胞凋亡早期的發生,其中Annexin V為胞內蛋白膜聯蛋白家族成員,以鈣離子依賴的方式選擇性與磷脂酰絲氨酸(PS)結合。

PS正常分布在細胞膜內側,即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期,不同類型的細胞都會把PS外翻到細胞膜外側。用帶有FITC標記的Annexin V,即Annexin V-FITC,就可以通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測到PS的外翻這一細胞凋亡的重要特征。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑,在嵌入DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細胞膜,但可以穿透壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞。因此,將Annexin V與PI聯合使用時,PI被排除在活細胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)外,而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結合染色呈現雙陽性(Annexin V+/PI+)。

FITC最大吸收波長為490nm,激發波長為525nm,PI-DNA復合物的最大吸收和發射波長分別為535nm和615nm。 
 
實驗數據



圖1. 在凋亡激活劑2(MB4124)孵育C6細胞(大鼠神經膠質瘤細胞)1.5小時后,使用我公司Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測染色效果圖。僅被綠色熒光染色的為凋亡前期細胞,被綠色和紅色雙染的是凋亡晚期或壞死細胞。

 


圖2. 使用我公司Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒染色后流式細胞儀檢測效果圖。A549細胞(人非小細胞肺癌細胞)用100μM凋亡激活劑2(MB4124)作用5小時后,未經染色(A)、僅用本試劑盒中的PI進行染色(B)、僅用本試劑盒中的Annexin V-FITC進行染色(C)、用本試劑盒中的Annexin V-FITC和PI進行雙染(D)。從圖中可以看出,未經染色的是雙陰性細胞(A),僅PI染色后出現了預期的PI染色陽性的細胞,僅Annexin V-FITC染色出現了預期的Annexin V-FITC染色陽性的細胞,Annexin V-FITC和PI雙染出現了預期的僅Annexin V-FITC染色陽性的早期凋亡細胞和雙陽性的晚期凋亡細胞。出現的非預期的細胞點完全在許可的誤差范圍內。實測數據可能會因細胞類型、細胞凋亡情況、檢測儀器等的不同而存在差異,圖中數據僅供參考。


操作步驟

1. 樣品染色

1) 將Binding Buffer(10×)稀釋成1×Binding buffer工作液備用(1ml Binding Buffer(10×)需加入9ml無菌去離子水)。

2) 對于懸浮細胞,500-1000g離心5min收集細胞。

對于貼壁細胞,要用不含EDTA的胰酶消化細胞,胰酶消化時間不宜過長或過短,最好是在輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時,加入細胞培養液,將細胞輕輕吹打下來,轉移到離心管內,500-1000g離心5min收集細胞。

3) 收集細胞后,加入預冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌,離心收集細胞,共洗滌兩次。

4) 在細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液,重懸細胞,使細胞濃度達到1×106 cell/ml。

5) 吸取100μl細胞懸液(細胞總數為1×105 cell)至一新管中,加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI,輕輕混勻,室溫避光孵育15min。

2. 樣品檢測

1) 流式細胞儀檢測:

染色孵育后,每管加入400μl 1×Binding Buffer工作液,混勻后使用流式細胞儀檢測(1小時內檢測)。

建議設置經凋亡誘導的正常細胞、PI單染和Annexin V-FITC單染3個對照組,正常細胞組可作為熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。結果可用CellQuest等軟件進行分析,繪制雙色散點圖(two-color dot plot),FITC為橫坐標,PI為縱坐標。Annexin V-FITC和PI聯合使用時,活細胞僅有很低強度的背景熒光,早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光,晚期凋亡細胞有綠色和紅色雙重熒光。

2) 熒光顯微鏡檢測:

染色孵育后涂片,顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結合的細胞顯示漿膜上有綠色光環。喪失細胞膜完整性的細胞,細胞核顯示紅色,膜上有綠色光環。


保存條件

2-8℃避光保存,一年有效。Annexin V-FITC不可冷凍。


注意事項

1. 可立式離心管內試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體甩至管底,避免開蓋時液體灑落。

2. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)是光敏物質,在保存與操作時請注意避光。

3. 在細胞洗滌的最后一步,請盡量將上清棄凈,以免PBS殘留影響實驗結果。

4. 為獲得準確試驗結果,建議樣品在Annexin V-FITC染色后1小時內進行分析。

5. 為了您的安全和健康,請穿戴實驗防護服、手套、口罩等必要的防護裝備。

我司所售出產品僅供于科研研究用途(非臨床科研研究),每次銷售產品行為都適用于我司網上所列明的通用銷售條款

英文名字:Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit
質量標準:Meilunbio
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摩爾濃度計算器 (本計算器可幫助您計算出特定溶液中溶質的質量、溶液濃度和體積之間的關系)
摩爾濃度計算公式:質量 (g) = 濃度 (mol/L) x 體積 (L) x 分子量 (g/mol)
質量(g
=
濃度 (mol/L)
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體積 (L)
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